lunes, 12 de diciembre de 2011

DIAGNOSTICO DE HEMOPARASITOS


Un gran número de protozoarios con localización hemática parasitan a los animales domésticos causando grandes pérdidas económicas ya sea por muerte de los mismos o por deterioro del organismo con la consecuente disminución de la cantidad y calidad de sus productos y subproductos.  A nivel del sistema hemático existen protozoarios conocidos como hematozoarios por su localización hemática ( Babesias Tripanosomas y Anaplasmas ) y larvas de nematodos ( filarias ) con alta capacidad patógena de importancia en la economía nacional.

Por la localización de los parásitos, la muestra que se debe tomar para solicitar los diagnósticos correspondientes es la  sangre.  Para la realización de exámenes directos, es suficiente la toma de 2 cc de sangre con anticoagulante. Para los exámenes indirectos se debe tomar aproximadamente 5 cm de sangre y sin anticoagulante, con el fin, de obtener suero en cantidad necesaria.  El proceso de centrifugación permite obtener el suero en mayor cantidad y pureza.  Se recomienda trabajar las muestras de suero hasta seis horas después de la toma para evitar su contaminación y la hemólisis de los eritrocitos. La contaminación en sueros refrigerados se puede evitar agregando fenol en concentración al 0.5%  Los sueros obtenidos se pueden conservar a temperaturas de –20°C  por tiempo aproximado de un año y por mas tiempo a –80°C para evitar el cambio d de las proteínas existentes en el suero

Toma de muestras de sangre:  Es necesario la esterilización de todo el material a utilizar en la toma, envase, conservación y envío de las muestras. y desinfección de la zona seleccionada para la toma de sangre.

La agujas a utilizar, deben tener calibres proporcionados a la especie animal y lugar a sangrar.  Se recomienda, utilizar calibres de 12-14 x 2.5-3 pulgadas  a nivel yugular  para bovinos equinos, ovinos y caprinos.  Calibres  de 18–20 x 1.5-4 pulgadas  en la vena cava anterior o marginal de la oreja para  porcinos. Calibres de 20 – 25 x 1-2  pulgadas en la vena cefálica y safena para caninos, perros y ratones.  Calibres de 25-26 x ½-1 pulgadas en la vena radial de aves.

Anticoagulantes:  Para la obtención de muestras a utilizar en diagnósticos directos, se recomienda la utilización de anticoagulantes como: heparina, Citrato de sodio, Citrato de potasio, fluoruro de sodio o la sal sódica o potásica del ácido etileno diaminotetracético  ( E D T A ).

La sal dipotásica del etileno diaminotetracético es de preferencia como anticoagulante, por mantener una máxima solubilidad en el agua al 10%.  Actúa fijando los iones de calcio en su estructura molecular e impidiendo que el calcio libre pueda entrar en la coagulación  La utilización de éste anticoagulante permite hasta por 24 horas recuentos celulares y valoración del hematocrito.  Permite conservar la morfología de los eritrocitos, mantiene constante la velocidad en las primeras seis horas  e impide la adherencia de las plaquetas a la superficie de los recipientes.

La presentación del EDTA se encuentra comercialmente en frascos de 100gr permitiendo su rápida preparación para la toma de muestras (Se debe preparar al 10% ( 10 gr. de EDTA en 100 cc de agua destilada )  La cantidad recomendable a utilizar es la de 1-2 gotas del anticoagulante por cada 5 ml de sangre

Envío de muestras al laboratorio  El envío de muestras para diagnóstico, exige condiciones de las cuales puede depender el éxito o fracaso de los exámenes a realizar.  Se requiere de sistemas o medios adecuados de refrigeración, recipientes de transporte debidamente esterilizados y adecuadamente fijados para evitar su deterioro en el trayecto de envío.

La muestra que se envía al laboratorio debe registrar datos referentes al nombre y dirección de la persona o entidad propietaria del animal, dirección del predio o finca, nombre y dirección de quién envía la muestra. Reseña completa que permita caracterizar el animal con datos precisos sobre edad, sexo, peso, raza y actividad entre otros.  Es de gran ayuda al laboratorista la información sobre antecedentes de enfermedades, muertes, diagnósticos y condiciones de manejo que se hayan dado en el lugar de procedencia; 

PREPARACIÓN DE FROTIS SANGUÍNEOS
las láminas o portaobjetos impregnados de sangre y coloreados se utilizan para una evaluación de los elementos sanguíneos, cuando se requiera su estudio en un determinado momento, ya sea con fines de investigación, o que se sospeche de una enfermedad de origen parasitario:  Babesias, Tripanosomas. Anaplasmas o microfilarias . 

La forma de preparar los frotis sanguíneos puede lograrse utilizando dos láminas portaobjetos o un portaobjeto y laminilla

Técnica:
Colocar en una superficie plana y horizontal, una lámina portaobjeto, limpia y desengrasada
Colocar una gota de sangre fresca en uno de los extremos de la lámina
Con otro portaobjeto y ángulo de 35° colocado sobre la gota de sangre, esperar que capilarice la sangre por el borde
Deslizar la lamina sobre el otro portaobjeto una sola vez y sin parar
Dejar secar a medio ambiente o a estufa
Fijar y colorear

COLORACIÓN PARA PROTOZOARIOS HEMÁTICOS
La coloración para protozoarios hemáticos (hematozoarios)tiene como finalidad el poder reconocer los diferentes parásitos y facilitar un diagnóstico mas exacto , luego de relizar el  correspondiente examen clínico.  Debe tenerse en cuenta que la mayor ayuda para un clínico es la utilización del laboratorio para lograr diagnósticos seguros que permita la instauración o aplicación de tratamientos eficientes y sistemas de profilaxis adecuados.

Las coloraciones corrientemente utilizadas corresponden a las de Wright y Giemsa.

Coloración de Wright.

 El colorante de Wright es el mas usado en nuestro medio para el diagnóstico de Hematozoarios.  El colorante esta compuesto de: Azul de metileno ( que tiñe los componentes ácidos como el núcleo y el RNA citoplasmático) y la eosina (que tiñe de rojo los componentes básicos como la hemoglobina)
Preparación del colorante Wright.

Colorante Wright                    0.3 g
Metanol                                  100 cc

Colocar en un mortero el colorante y adicionar periódicaamente el alcohol mientras se va macerando durante unos 15 minutos .  Finalmente se debe filtrar y almacenar en frasco oscuro y tapar.  Este colorante se encuentra preparado a nivel comercial.  Se recomienda filtrar siempre la cantidad que se desee utilizar. 


Técnica.
Secar el frotis sanguíneo previamente preparado y luego fijarlo en alcohol
Colocar la lámina sobre un soporte con el frotis hacia arriba
Cubrir totalmente la lámina con el colorante  durante tres minutos y un máximo de cuatro
Dejar el colorante durante 5 – 7 minutos
Lavar con agua destilada
Dejar secar a medio ambiente
Mirar al microscopio con objetivo de 100X y aceite de inmersión

Coloración de Giemsa
Preparación del colorante
Giensa (polvo)                                   0.75 g
Glicerina pura                                  35.0  cc

Mezclar ambas sustancias en un envase de vidrio que contenga perlas de vidrio.
Dejar en maduración  encubando a 60 °C  durante 12 a18 horas y agitar periódicamente cada hora
Agregar alcohol metílico puro en cantidad de 65 cc después de enfriada la mezcla anterior
Tapar bien el colorante para evitar evaporación y contaminación con polvo ambiental

Técnica
Dejar secar el frotis sanguíneo a medio ambiente
Fijar el frotis en alcohol metílico absoluto durante dos a tres minutos
Secar a medio ambiente el frotis
Sumergir la lámina en el colorante de Giensa durante 20 a 30 minutos
Lavar con agua destilada y colocar la lámina verticalmente
Dejar secar al aire
Mirar al microscopio con objetivo de 100X y aceite de inmersión

DIAGNOSTICO DE FILARIASIS. 
El diagnostico de la filariasis se basa en el hallazgo de sus primeras larvas o microfilarias.  La muestra a examinar debe ser sangre por considerarse la vía evolutiva que buscan las microfilarias para alcanzar a su vectores.

Las técnicas comúnmente utilizadas para el diagnostico directo de microfiliarias utilizan sangre con anticoagulante en proporción de y gota de Ácido etil-diamino- tetra-acético (EDTA) por cada 1-2 ml de sangre, corresponden a: Preparaciones frescas, Woo del tubo capilar y Knott modificado.

Técnica de preparaciones frescas.  De gran utilidad para diagnósticos rápidos y para parásitos con movimiento propio.

Método.  Se toma una gota de sangre y se coloca sobre un portaobjeto.  Se cubre con una lamina y se observa con objetivo de menor aumento.

Técnica de Woo del tubo capilar.   Consiste en la misma técnica del microhematocrito.  Se utiliza para diagnosticar parásitos con movimiento propio al igual que la anterior y específicamente para Tripanosomas y microfilarias.

Técnica. Se llenan los microhematocritos.  Se taponan de un lado y se centrifugan a 1500 revoluciones por minuto durante 3-5 minutos.  Los microhematocritos se colocan en una lamina de woo y se fijan al portaobjeto.  La observación se hace en la zona que separa el sedimento del plasma.  La lectura se hace con objetivo de menor aumento.

Técnica de Knott modificado.  Se utiliza para clasificar microfilarias, especialmente en animales donde existen más de una filaria.  Consiste en matar las microfilarias y colorearlas para mirar sus estructuras y tamaños.

Técnica. Tomar 9 ml de la sangre positiva a microfilarias, detectada por cualquiera de los métodos anteriormente indicados.  Agregar 1ml  de formalina al 10% con el fin de fijar las microfilarias.  Centrifugar a 1500 revoluciones  por minuto durante 3-5 minutos.  Eliminar el sobrenadante.  Agregar 2-6 gotas de azul metileno al  1:10000.  Observar gota a gota el sedimento sobre un portaobjeto, colocar una laminilla y observar su objetivo de menor aumento. 

1 comentario:

  1. Muy buena y necesaria información, muchas gracias. Sobre todo lo del tiempo de las muestras que es en lo que constántemente cometen errores y salen resultados falsos.

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