lunes, 12 de diciembre de 2011

DIAGNOSTICO DE HEMOPARASITOS


Un gran número de protozoarios con localización hemática parasitan a los animales domésticos causando grandes pérdidas económicas ya sea por muerte de los mismos o por deterioro del organismo con la consecuente disminución de la cantidad y calidad de sus productos y subproductos.  A nivel del sistema hemático existen protozoarios conocidos como hematozoarios por su localización hemática ( Babesias Tripanosomas y Anaplasmas ) y larvas de nematodos ( filarias ) con alta capacidad patógena de importancia en la economía nacional.

Por la localización de los parásitos, la muestra que se debe tomar para solicitar los diagnósticos correspondientes es la  sangre.  Para la realización de exámenes directos, es suficiente la toma de 2 cc de sangre con anticoagulante. Para los exámenes indirectos se debe tomar aproximadamente 5 cm de sangre y sin anticoagulante, con el fin, de obtener suero en cantidad necesaria.  El proceso de centrifugación permite obtener el suero en mayor cantidad y pureza.  Se recomienda trabajar las muestras de suero hasta seis horas después de la toma para evitar su contaminación y la hemólisis de los eritrocitos. La contaminación en sueros refrigerados se puede evitar agregando fenol en concentración al 0.5%  Los sueros obtenidos se pueden conservar a temperaturas de –20°C  por tiempo aproximado de un año y por mas tiempo a –80°C para evitar el cambio d de las proteínas existentes en el suero

Toma de muestras de sangre:  Es necesario la esterilización de todo el material a utilizar en la toma, envase, conservación y envío de las muestras. y desinfección de la zona seleccionada para la toma de sangre.

La agujas a utilizar, deben tener calibres proporcionados a la especie animal y lugar a sangrar.  Se recomienda, utilizar calibres de 12-14 x 2.5-3 pulgadas  a nivel yugular  para bovinos equinos, ovinos y caprinos.  Calibres  de 18–20 x 1.5-4 pulgadas  en la vena cava anterior o marginal de la oreja para  porcinos. Calibres de 20 – 25 x 1-2  pulgadas en la vena cefálica y safena para caninos, perros y ratones.  Calibres de 25-26 x ½-1 pulgadas en la vena radial de aves.

Anticoagulantes:  Para la obtención de muestras a utilizar en diagnósticos directos, se recomienda la utilización de anticoagulantes como: heparina, Citrato de sodio, Citrato de potasio, fluoruro de sodio o la sal sódica o potásica del ácido etileno diaminotetracético  ( E D T A ).

La sal dipotásica del etileno diaminotetracético es de preferencia como anticoagulante, por mantener una máxima solubilidad en el agua al 10%.  Actúa fijando los iones de calcio en su estructura molecular e impidiendo que el calcio libre pueda entrar en la coagulación  La utilización de éste anticoagulante permite hasta por 24 horas recuentos celulares y valoración del hematocrito.  Permite conservar la morfología de los eritrocitos, mantiene constante la velocidad en las primeras seis horas  e impide la adherencia de las plaquetas a la superficie de los recipientes.

La presentación del EDTA se encuentra comercialmente en frascos de 100gr permitiendo su rápida preparación para la toma de muestras (Se debe preparar al 10% ( 10 gr. de EDTA en 100 cc de agua destilada )  La cantidad recomendable a utilizar es la de 1-2 gotas del anticoagulante por cada 5 ml de sangre

Envío de muestras al laboratorio  El envío de muestras para diagnóstico, exige condiciones de las cuales puede depender el éxito o fracaso de los exámenes a realizar.  Se requiere de sistemas o medios adecuados de refrigeración, recipientes de transporte debidamente esterilizados y adecuadamente fijados para evitar su deterioro en el trayecto de envío.

La muestra que se envía al laboratorio debe registrar datos referentes al nombre y dirección de la persona o entidad propietaria del animal, dirección del predio o finca, nombre y dirección de quién envía la muestra. Reseña completa que permita caracterizar el animal con datos precisos sobre edad, sexo, peso, raza y actividad entre otros.  Es de gran ayuda al laboratorista la información sobre antecedentes de enfermedades, muertes, diagnósticos y condiciones de manejo que se hayan dado en el lugar de procedencia; 

PREPARACIÓN DE FROTIS SANGUÍNEOS
las láminas o portaobjetos impregnados de sangre y coloreados se utilizan para una evaluación de los elementos sanguíneos, cuando se requiera su estudio en un determinado momento, ya sea con fines de investigación, o que se sospeche de una enfermedad de origen parasitario:  Babesias, Tripanosomas. Anaplasmas o microfilarias . 

La forma de preparar los frotis sanguíneos puede lograrse utilizando dos láminas portaobjetos o un portaobjeto y laminilla

Técnica:
Colocar en una superficie plana y horizontal, una lámina portaobjeto, limpia y desengrasada
Colocar una gota de sangre fresca en uno de los extremos de la lámina
Con otro portaobjeto y ángulo de 35° colocado sobre la gota de sangre, esperar que capilarice la sangre por el borde
Deslizar la lamina sobre el otro portaobjeto una sola vez y sin parar
Dejar secar a medio ambiente o a estufa
Fijar y colorear

COLORACIÓN PARA PROTOZOARIOS HEMÁTICOS
La coloración para protozoarios hemáticos (hematozoarios)tiene como finalidad el poder reconocer los diferentes parásitos y facilitar un diagnóstico mas exacto , luego de relizar el  correspondiente examen clínico.  Debe tenerse en cuenta que la mayor ayuda para un clínico es la utilización del laboratorio para lograr diagnósticos seguros que permita la instauración o aplicación de tratamientos eficientes y sistemas de profilaxis adecuados.

Las coloraciones corrientemente utilizadas corresponden a las de Wright y Giemsa.

Coloración de Wright.

 El colorante de Wright es el mas usado en nuestro medio para el diagnóstico de Hematozoarios.  El colorante esta compuesto de: Azul de metileno ( que tiñe los componentes ácidos como el núcleo y el RNA citoplasmático) y la eosina (que tiñe de rojo los componentes básicos como la hemoglobina)
Preparación del colorante Wright.

Colorante Wright                    0.3 g
Metanol                                  100 cc

Colocar en un mortero el colorante y adicionar periódicaamente el alcohol mientras se va macerando durante unos 15 minutos .  Finalmente se debe filtrar y almacenar en frasco oscuro y tapar.  Este colorante se encuentra preparado a nivel comercial.  Se recomienda filtrar siempre la cantidad que se desee utilizar. 


Técnica.
Secar el frotis sanguíneo previamente preparado y luego fijarlo en alcohol
Colocar la lámina sobre un soporte con el frotis hacia arriba
Cubrir totalmente la lámina con el colorante  durante tres minutos y un máximo de cuatro
Dejar el colorante durante 5 – 7 minutos
Lavar con agua destilada
Dejar secar a medio ambiente
Mirar al microscopio con objetivo de 100X y aceite de inmersión

Coloración de Giemsa
Preparación del colorante
Giensa (polvo)                                   0.75 g
Glicerina pura                                  35.0  cc

Mezclar ambas sustancias en un envase de vidrio que contenga perlas de vidrio.
Dejar en maduración  encubando a 60 °C  durante 12 a18 horas y agitar periódicamente cada hora
Agregar alcohol metílico puro en cantidad de 65 cc después de enfriada la mezcla anterior
Tapar bien el colorante para evitar evaporación y contaminación con polvo ambiental

Técnica
Dejar secar el frotis sanguíneo a medio ambiente
Fijar el frotis en alcohol metílico absoluto durante dos a tres minutos
Secar a medio ambiente el frotis
Sumergir la lámina en el colorante de Giensa durante 20 a 30 minutos
Lavar con agua destilada y colocar la lámina verticalmente
Dejar secar al aire
Mirar al microscopio con objetivo de 100X y aceite de inmersión

DIAGNOSTICO DE FILARIASIS. 
El diagnostico de la filariasis se basa en el hallazgo de sus primeras larvas o microfilarias.  La muestra a examinar debe ser sangre por considerarse la vía evolutiva que buscan las microfilarias para alcanzar a su vectores.

Las técnicas comúnmente utilizadas para el diagnostico directo de microfiliarias utilizan sangre con anticoagulante en proporción de y gota de Ácido etil-diamino- tetra-acético (EDTA) por cada 1-2 ml de sangre, corresponden a: Preparaciones frescas, Woo del tubo capilar y Knott modificado.

Técnica de preparaciones frescas.  De gran utilidad para diagnósticos rápidos y para parásitos con movimiento propio.

Método.  Se toma una gota de sangre y se coloca sobre un portaobjeto.  Se cubre con una lamina y se observa con objetivo de menor aumento.

Técnica de Woo del tubo capilar.   Consiste en la misma técnica del microhematocrito.  Se utiliza para diagnosticar parásitos con movimiento propio al igual que la anterior y específicamente para Tripanosomas y microfilarias.

Técnica. Se llenan los microhematocritos.  Se taponan de un lado y se centrifugan a 1500 revoluciones por minuto durante 3-5 minutos.  Los microhematocritos se colocan en una lamina de woo y se fijan al portaobjeto.  La observación se hace en la zona que separa el sedimento del plasma.  La lectura se hace con objetivo de menor aumento.

Técnica de Knott modificado.  Se utiliza para clasificar microfilarias, especialmente en animales donde existen más de una filaria.  Consiste en matar las microfilarias y colorearlas para mirar sus estructuras y tamaños.

Técnica. Tomar 9 ml de la sangre positiva a microfilarias, detectada por cualquiera de los métodos anteriormente indicados.  Agregar 1ml  de formalina al 10% con el fin de fijar las microfilarias.  Centrifugar a 1500 revoluciones  por minuto durante 3-5 minutos.  Eliminar el sobrenadante.  Agregar 2-6 gotas de azul metileno al  1:10000.  Observar gota a gota el sedimento sobre un portaobjeto, colocar una laminilla y observar su objetivo de menor aumento. 

PARASITOLOGIA VETERINARIA, TECNICAS DE DIAGNOSTICO COPROLOGICO

Recolección de materias fecales.  Las materias fecales que se utilizan para diagnósticos parasitarios se deben tomar directamente del recto por encontrarse libres de elementos extraños que puedan impedir su interpretación.  De no lograr extraerlas directamente del recto, pueden  tomarse para el estudio, las materias fecales logradas al momento de la deposición o en caso extremo las materias frescas encontradas en el piso, libres de cuerpos extraños, de tierra o de heces de otros animales.

Obtención: Las muestras se pueden obtener mediante el uso de guantes quirúrgicos o bolsas de polipropileno de pared delgada que permita la penetración completa de la mano o del dedo según la especie animal a evaluar.  Las bolsas de polipropileno tienen la ventaja de ser desechables y permiten ser utilizadas como medio de envase, conservación y transporte.  Se recomienda, antes de introducir la mano con la bolsa  o el guante en el recto (en grandes animales) o el dedo (en pequeñas especies ) humedecer la bolsa con agua corriente al igual que la región anal para no maltratar al animal

En animales de poca edad o en los que sea imposible la penetración rectal del dedo, se debe utilizar cánulas con bordes no cortantes o utilizar el material adherido al termómetro al momento de tomar la temperatura rectal.  A los  animales que no se les pueda obtener la materia fecal, por ser estíticos, o presentar poca evacuación se deben aislar  individualmente en lugares limpios y obtener las materias fecales del suelo. También se recomienda al no obtener las muestras del recto, la aplicación de un enema rectal de agua corriente, centrifugar el material obtenido y el sedimento procesarlo a través de métodos coprológicos de enriquecimiento como solución salina o azucarada saturada.

Recipientes para envío de muestras. Las materias fecales por lo general se envían en bolsas de polipropileno con que se toman las muestras y que se invierten sobre sí mismas. Las bolsas se cierran con  dos nudos y se incluye la identificación del animal en el espacio de los nudos, impidiendo que la humedad borre la identificación del animal.  Cuando se utilizan frascos como recipientes de envío, se deben utilizar de boca ancha y llenarlos en su totalidad con el fin de eliminar el aire y evitar la velocidad de desarrollo y eclosión de huevos de parásitos

Cantidad de materia fecal para diagnósticos  La cantidad de materia fecal a enviar esta relacionada con la especie animal que se desea evaluar y con el número de exámenes o técnicas  a  practicar, o la posibilidad de contar con material si se desea repetir algunos exámenes.  En los bovinos y equinos es recomendable el envío aproximado de 100 gr de materia fecal, considerando que se pueden evaluación de parasitismo gastrointestinal (helmintos y protozoarios ) parasitismo hepático y parasitismo pulmonar.   En las especies porcina, ovina  y caprina se deben enviar 50gr.  En conejos aproximadamente 10 bolos o el intestino completo. En aves se recomienda enviar el intestino completo o un ave con signos representativos del problema parasitario que se sospecha o que se desea confirmar.

Conservación de materias fecales.  Las muestras de materia fecal deben tomarse por lo general en las primeras horas de la mañana y cuando el animal no ha ingerido ningún tipo de alimento.  Las muestras obtenidas deben enviarse al laboratorio y procesarse de inmediato especialmente en climas cálidos donde el desarrollo de huevos y procesos de eclosión se produce mas rápidamente.

Cuando exista dificultad para realizar el examen pocas horas después de la toma, se deben conservar en refrigeración (climas fríos) o agregar a las muestras soluciones de formaldehído o formalina al 10 o 20 % en agua o solución salina fisiológica.  Para cada 10gr de materia fecal se debe agregar 1a 2 ml de la solución indicada y mezclar homogéneamente todo el material para la preservación total de la muestra.

Para  exámenes  coprológicos  donde se desea investigar la presencia de larvas de helmintos pulmonares (bronquitis verminosa), no se recomienda utilizar ningún preservativo ya que el diagnostico se fundamenta en la migración de larvas que deben permanecer vivas a la observación.  Tampoco se debe utilizar preservativos en las muestras que se quiera determinar la presencia de trofozoitos o quistes de protozoarios intestinales, normalmente estas formas parasitarias se destruyen  a las pocas horas, siendo imposible su diagnóstico. Su observación inmediata o una refrigeración moderada es lo mas recomendable.

EXAMENES COPROLÓGICOS
La utilización de diferentes técnicas en los exámenes coprológicos permite evaluar o determinar los agentes parasitarios causantes de las enfermedades, confirmando los diagnósticos presuntivos que se hacen a la valoración clínica de los animales.  Es necesario, conocer una adecuada metodología del trabajo de laboratorio para lograr diagnósticos precisos o por lo menos confiables que orienten las apreciaciones clínicas y garanticen un buen tratamiento. 

Examen macroscópico.  Debe realizarse inmediatamente a las muestras tomadas, considerándose su consistencia, color, olor, presencia de mucosas, sangre, coágulos, cuerpos extraños y aún  la posibilidad de encontrar parásitos o partes de ellos, elementos de importancia para evitar errores de procedimiento.

Examen microscópico.  Debe ser realizado por laboratoristas o expertos en el conocimiento de técnicas, procedimientos y de las entidades u organismos a evaluar, con capacidad de interpretar las características macroscópicas de las muestras con los anamnésicos reportados y las enfermedades que padecen los animales.  Es necesario contar con condiciones mínimas de laboratorio, con los materiales, soluciones y reactivos indispensables para procesar las diferentes técnicas

DIAGNOSTICO DE HUEVOS E HELMINTOS EN MATERIA FECAL, TEJIDOS

Y PASTOS

DIAGNOSTICO DE HUEVOS E HELMINTOS EN MATERIA FECAL

Técnicas coprológicas.  La valoración parasitaria en muestras de materia fecal  se realiza a través de técnicas que indican la presencia o cuantifican el grado de infección causado por los parásitos.  Lo anterior y para mayor comprensión del tema, permite clasificar las técnicas coproparasitarias en técnicas cualitativas y técnicas cuantitativas.   

Técnicas cualitativas.  Son de gran ayuda por poder realizarse en forma rápida durante el examen clínico, brindando elementos de fuerza para llegar a diagnósticos mas precisos. Estas técnicas no indican la cantidad de parásitos existentes pero informan en términos cualitativos el grado de la infección.  Tradicionalmente  se ha utilizado el sistema de cruces según campos microscópicos para valorar el grado de infección, al igual que se hace para determinar presencia bacterias, hematíes y otras células en los exámenes de orina.

Algunos términos cualitativos que pueden orientar al clínico corresponden a Infecciones  bajas, leves, moderadas y graves.  Correspondiéndose con el sistema de cruces según el número de formas parasitarias así:

Infección baja:   ( Campos con  1 a 3 formas )  =  Una cruz.  ( + )
Infección leve:   ( Campos con  4 a 7 formas )  =   Dos cruces.  ( + + )
Infección moderada  ( Campos con  8 a 10 formas ) = Tres cruces (++ + )
Infección grave: (Campos con mas de 10 formas  )   = Cuatro cruces  (+++ + )

El número de formas para indicar el grado de infección es a criterio particular de quién realiza el examen al igual que el número de campos microscópicos observables.  Se recomienda hacer lectura de cinco campos escogidos al azar en la preparación o frotis. Los métodos comunes de técnicas cualitativas son los siguientes

Método de Frotis directo. (Preparaciones frescas).  De gran utilidad en el diagnóstico de formas vegetativas o quísticas de protozoarios intestinales, y de huevos de helmintos.  Se requiere de muestras frescas para evitar la alteración de formas vegetativas o quísticas de  protozoariOs o el desarrollo de huevos de helmintos a estados de mórula o larvas que impiden el adecuado reconocimiento.


Técnica

  • En una lámina portaobjeto colocar una o dos gotas de solución salina
  • fisiológica* o isotónica **
§  Con un palillo o espátula, colocar sobre la solución un poco de heces frescas
      evitando la presencia de partículas de arena u otros cuerpos extraños.
§  Mezclar con la solución salina hasta obtener una película poco gruesa y clara
  • Colocar una laminilla sobre la preparación de haces
  • Mirar al microscopio con objetivo de 10X 40X

* Solución salina fisiológica:  Se prepara con 8.5 g de Cloruro de sodio (NaCl) en  1000 cc de agua destilada. Calentar a 50°C hasta disolver completamente la sal
** Solución de Ringer o Solución salina isotónica .Se prepara con    0.42 g de Cloruro de potasio, 0.24 g de Cloruro de sodio, 0.20 g de Bicarbonato de sodio en 1000cc de agua destilada.

Métodos de concentración o enriquecimiento. Se fundamenta en la utilización de soluciones que obligan a la concentración de las formas parasitarias como huevos o larvas, para luego ser recuperadas y observadas.  Son varias las técnicas de enriquecimiento que permiten la utilización de métodos de flotación, sedimentación o migración larvaria.

Método de Flotación con solución salina saturada .  De uso corriente en las prácticas de diagnóstico en veterinaria por ser rápida, brindar buenos resultados y facilidad de preparación de la solución.

Técnica

  • Colocar de 2-5 g. De heces en un mortero
  • Agregar de 30 a50 cc de solución salina saturada*
  • Disolver con una espátula o varilla de vidrio
  • Filtrar con un cedazo de mallas finas
  • Llenar uno o dos tubos de ensayo por encima del borde (menisco convexo)
  • Eliminar las burbujas o sustancias que flotan
  • Colocar una laminilla encima del tubo de 15 a 30 minuto
  • Retirar la laminilla y colocarla en un portaobjeto
  • Mirar al microscopio con objetivo de 10X

* Solución salina saturada   Se prepara con 331g de Cloruro de sodio (NaCl) en  1000 cc de agua destilada. Calentar a 50°C hasta disolver

Técnica de flotación sencilla.
  • Colocar en un tubo de ensayo pequeñas cantidades de heces
  • Mezclar las materias fecales
  • Llenar hasta el borde con solución salina saturada
  • Colocar una laminilla en el borde del tubo por tiempo de 3 a 5 minutos
  • Retirar la laminilla y colocarla en un portaobjeto
  • Mirar al microscopio con objetivo de 10X 40X.

La solución salina puede ser reemplazada por las siguientes soluciones :

Solución  azucarada de  Sheather  Se prepara con 454 g de azúcar,   6 cc de fenol o formol  en 355 cc de agua destilada
Solución de sulfato de magnesia Se prepara con 331 g de sulfato de magnesia en 1000 cc de agua destilada.

Método de Graham   Conocido con el nombre de Técnica de cinta de celofán, de utilidad en el diagnóstico de oxiuros equinos y humanos y de tenias caninas del género Dipylidium.  Se fundamenta en lograr la adhesión de huevos o segmentos de parásitos en la cinta y recuperarlos posteriormente por sistema de sedimentación .

Técnica

  • Colocar una cinta adhesiva en la región perianal
  • Retirar la cinta y montarla en una lamina
  • Observar al microscopio con objetivo de 10X

Modificación del método de Grahan para oxyurosis equina
En equinos se recomiendan las siguientes modificaciones:
  • Lavar la región anal y perianal con solución salina o con agua destilada
  • Exprimir las torundas de algodón o gasa utilizadas en un beaker con capacidad de 500cc
  • Centrifugar el material obtenido a 1500 r. p.m. y eliminar el sobrenadante
  • Colocar el sedimento en láminas
  • Observar al microscopio con objetivo de 10X

Técnicas cuantitativas  Indican la cantidad de parásitos existentes informando el grado de la infección.  Tradicionalmente se ha utilizado el sistema de valoración de h.p.g (huevos por gramo) o de l.p.g. (larvas por gramo) según sean las formas parasitarias diagnosticadas. En Medicina Veterinaria  es frecuente el uso de las siguientes técnicas:  Dennis, Borays Pearson, McMaster, Soll Modificado y Baerman

Métodos para diagnóstico de tremátodos  Para el diagnóstico de helmintos tremátodos y específicamente para Fasciola hepática se utiliza la técnica de Dennis, fundamentada en repetidos lavados y filtrados  de la muestra fecal y la observación posterior de huevos obtenidos por procesos de sedimentación.


Técnica de Dennis
  • Pesar 2g de materia fecal
  • Colocarlos en un recipiente o mortero con capacidad de 100 cc.
  • Agregar 25 cc de solución detergente*
  • Mezclar con un agitador sin formar espuma
  • Colocar una malla metálica ( No.80 ) en un embudo
  • Filtrar la suspensión en un  tubo de 50 cc
  • Lavar con solución detergente el recipiente que contenía la muestra
  • Filtrar el lavado y agregarlo al tubo de 50 cc
  • Adicionar solución detergente al sedimento de la malla hasta llenar el tubo
  • Dejar en reposo el tubo por tiempo de 5 a 10 minutos
  • Eliminar las ¾  partes del sobrenadante del líquido.
  • Lavar el embudo con solución detergente y agregarla al tubo
  • Llenar el tubo hasta el reborde con solución detergente
  • Dejar en reposo durante 10 minutos
  • Eliminar el sobrenadante del tubo, dejando 2 a 3 cc del sedimento
  • Agregar 1 a2 gotas de tintura de yodo y dejar en reposo de 2 a5 minutos
  • Verter el contenido en una caja de petri
  • Mirar al esteromicroscopio y contar los huevos de Fasciola hepática


Solución detergente: Se prepara con 5 cc de detergente líquido en 95 cc de agua destilada
Recuento: El número de huevos contados se divide por 2 y  se expresa en huevos por gramo (h.p

Técnica de Borays Pearson.
  • Pesar 5 g de materia fecal
  • Colocarlos en un recipiente o mortero con capacidad de 100 cc.
  • Agregar agua corriente y preparar una suspensión
  • Mezclar con un agitador sin formar espuma
  • Colocar una malla metálica ( No.80 ) en un embudo
  • Filtrar la suspensión en una probeta de 1000 cc
  • Lavar con agua el recipiente y el tamiz que contenían la muestra
  • Filtrar el lavado y agregarla a la probeta de 1000 cc
  • Adicionar agua hasta llenar la probeta
  • Dejar en reposo la probeta por tiempo de 5 minutos
  • Eliminar el sobrenadante dejando 100 a 200 cc del sedimento
  • Llenar nuevamente la  probeta con agua 
  • Dejar en reposo durante 5  (Repetir último paso tres veces)
  • Eliminar el sobrenadante de la probeta dejando 5 cc del sedimento
  • Agregar 3 a 5 gotas de azul de metileno al 1:1000
  • Agitar el sedimento y tomar 1 cc del sedimento
  • Preparar el número de láminas suficientes con el cc del sedimento
  • Mirar al microscopio con objetivo de 10X

Recuento: El número de huevos contados equivale al número de huevos por gramo de la muestra

Tecnica de McMaster

§  Pesar 2g de materia fecal recientemente tomadas.

§  Depositarla en un recipiente de Mc Master, calibrado a 28 cc.

§  Agregar 28 cc de solución azucarada sobresaturada de Sheather

§  Agitar o mezclar fuertemente hasta homogenizar

§  Tamizar en un colador o cedazo metálico ( No. 80 ) o colador común

§  Presionar el sedimento con una espátulas de madera y eliminar el contenido.

§  Llenar dos cámaras de Mc Master evitando la presencia de burbujas.

§  Mirar al microscopio con objetivo de 10X

§  El recorrido de la cámara debe hacerse trasladando el campo entre las columnas.

§  Recuento.  El cálculo se basa en el espacio de la cámara y el volumen de la solución a leer.  Cada cámara tiene un volumen de 1 cc.  El número total de cámara a leer debería ser de 30.  Razón por la cual debe leerse un mínimo de dos cámara, determinar el promedio de las mismas y multiplicar por la constante 30.

§  La formula para expresar el número de huevos por gramo (h.p.g) corresponde a la siguiente

             

 Recuento de la C1 + Recuento de la C2 ...x  30
                         Número de cámaras leídas


Método de Sloss modificado

Técnica

§  Pesar 2g de heces

§  Colocarlas en un beaker con capacidad de 40 cc

§  Agregar  20 cc de agua corriente

  • Agitar y homogenizar la muestra hasta formar una suspensión
  • Tamizar con un cedazo corriente ( No. 80 ) en una caja de petri
  • Agregar 10 cc de agua  para arrastrar los huevos existentes
  • Comprimir el sedimento con una espátula de madera
  • Desechar el sedimento
  • Distribuir los 30 cc en dos tubos de ensayo de 15 cc
  • Centrifugar a 1500  r. p.m. durante cinco minutos
  • Botar el sobrenadante y dejar 2 cc del sedimento
  • Agitar el sedimento y Colocar los tubos en una gradilla
  • Agregar solución azucarada hasta el borde de los tubos
  • Colocar una laminilla durante cinco minutos
  • Retirar las laminillas y colocarlas sobre un portaobjeto
  • Mirar al microscopio con objetivo de 10X

Recuento:  El cálculo requiere del conteo total de huevos discriminados por géneros de parásitos  El conteo por género se divide por dos y se obtiene el número de huevos por gramo ( h.p.g.) de la muestra

DIAGNOSTICO DE LARVAS DE HELMINTOS EN MATERIA FECAL, TEJIDOS

Y PASTOS

Método de Baerman.  Utilizado especialmente para el diagnóstico de parásitos pulmonares causantes de bronquitis verminosa. también se utiliza para exámenes de larvas en pastos o en tejidos.  Se fundamenta en lograr la eclosión de huevos y permitir por gravedad la migración de larvas al fondo del tubo que posteriormente son recuperadas por sistemas de sedimentación o centrifugación

Técnica
  • Organizar el aparato de baerman uniendo un tubo de ensayo a un embudo por
  • medio de una manguera
  • Colocar el aparato de baerman en un soporte o mesa para baerman
  • Llenar con agua el aparato de baerman hasta 1-2 cm por debajo del borde del
  • embudo
  • Colocar en el embudo un tamiz o malla metálica
  • Colocar 10 g de la muestra encima del tamiz en contacto con el agua por
  • Tiempo de 12 a 24 horas 
  • Cubrir con gasa para evitar la contaminación con artrópodos
  • Desmontar el aparato de baerman y retirar con cuidado el tubo de ensayo
  • Centrifugar a 1500 r.p.m. durante cinco minutos
  • Botar el sobrenadante y dejar de 1-2 cc de sedimento.
§  Colocar en una lamina 1-2 gotas del cubriéndolo con un portaobjeto hasta
§  agotarlo completamente
  • Mirar al microscopio con objetivo de 10X

Recuento.  Se basa en la lectura de todo el sedimento y el recuento  de todas las larvas existentes.  El reporte se da por el número de larvas contadas en la cantidad de materia fecal montada. Existen embudos de diferentes capacidades, lográndose mejores diagnósticos entre mayor sea la cantidad de materia fecal a examinar.

La técnica de Baerman, también es de utilidad para el diagnóstico de larvas de
nematodos existentes en músculos ( Trichinella spiralis ) y larvas existentes en pastos El método de Baerman digestivo  se fundamenta en la técnica anterior con las siguientes modificaciones:

Técnica de Baerman digestivo.
§  Montar el aparato de baerman según técnica estándar
§  Remplazar la materia fecal por 5 g de músculo en trozos finos
§  Remplazar el agua por solución digestiva artificial*
§  Incubar a37°C durante 12 horas
  • Desmontar el aparato de baerman y retirar con cuidado el tubo de ensayo
  • Centrifugar a 1500 r.p.m. durante cinco minutos
  • Botar el sobrenadante y dejar de 1-2 cc de sedimento.
§  Colocar en una lamina 1-2 gotas del cubriéndolo con un portaobjeto hasta
§  agotarlo completamente
  • Mirar al microscopio con objetivo de 10X
                                     
Solución digestiva artificial:  Se prepara con5 g de pepsina ala 1%, 11 cc de ácido clorhídrico al 0.75%, 10 cc de Cloruro de sodio al 0.15 Molar y agua bidestilada estéril, en cantidad suficiente para preparar 1000cc.

Baerman para diagnóstico de larvas en pasto: De importancia para conocer el grado de infestación existente en explotaciones ganaderas, especialmente al iniciar un programa de sanidad y tomar medidas de prevención.

Técnica
§  Elegir 5 sitios de muestreo al azar en el potrero seleccionado
§  Cortar un total de 300 g de pasto en horas de la mañana ( 6: a.m.)
§  Tomar las muestras de pasto 5 cm por encima del suelo
§  Empacar las muestras en bolsas plásticas y llevar inmediatamente al
§  Laboratorio para evitar la muerte larvaria
§  Procesar las muestras según método estándar de baerman 
  • Colocar la muestra encima del tamiz
  • Agregar agua al baño de maría ( 37-40°C) hasta dejar el pasto en el agua
  • Mover el pasto periódicamente para desprender las larvas
  • Desmontar el aparato de baerman a las 24 horas
  • Retirar con cuidado el tubo de ensayo
  • Centrifugar a 1500 r.p.m. durante cinco minutos
  • Botar el sobrenadante y dejar de 1-2 cc de sedimento.
§  Colocar en una lamina 1-2 gotas del cubriéndolo con un portaobjeto hasta agotarlo completamente
  • Mirar al microscopio con objetivo de 10X

Recuento:  El diagnóstico se da en número de larvas contadas según género de parásitos, con base en la cantidad de pasto montada




DIAGNOSTICO DE HUEVOS DE HELMINTOS EN ORINA

Los exámenes realizados en orina para el diagnóstico de parásitos, permiten el reconocimiento de huevos de Stephanurus dentatus en la especie porcina y de Capillaria plica en carnívoros.  La orina a obtener debe ser tomada a través de sondas, punción vesical o micción espontánea

Técnica:
§  Obtener entre 50 y 100 cc de orina.
§  Centrifugar la orina a 1500 r.p.m. durante 3-5 minutos
§  Decantar el sobrenadante
§  Colocar el sedimento en laminillas
§  Mirar al microscopio con objetivo de 10X

AISLAMIENTO Y CLASIFICACION DE HELMINTOS

Para el aislamiento de parásitos gastrointestinales se requiere del conocimiento preciso de la técnica de necropsia. para cada especie animal.  El procedimiento básico de la necropsia es el siguiente:

Técnica de necropsia
§  Colocar al animal sobre su dorso en una mesa y sujetar sus extremidades
§  Con bisturí o tijeras practicar una incisión en la cara interna de cada muslo
§  Desarticular haciendo presión hacia adentro y hacia fuera
§  Incidir la región axilar y desarticular
§  Hacer un corte longitudinal de la piel desde el extremo anterior del tórax continuando por la línea alba hasta terminar en la región púbica.
§  Separar piel, fascia y músculo cutáneo desde la región abdominal hasta el dorso de  la cara ventral del abdomen y del cuello
§  Incidir los músculos abdominales y penetrar a la cavidad abdominal
§  Seccionar las costillas a nivel de la articulaciones  cóndro- esternales y uniones
§  costo-vertebrales
§  Extender las porciones del tracto digestivo haciendo doble ligadura (5 cm entre ellas)
§  Retirar lengua, traquea y esófago de adelante hacia atrás
§  Aislar órganos abdominales 
§  Examinar órganos toráxicos, pleuras, columna. Cerebro.

Técnica de aislamiento de parásitos
§  Tomar el tracto digestivo obtenido de la necropsia
§  Cortar entre las dobles ligaduras separando esófago, estómago, intetestino delgado
§  ciego e intestino grueso.
§  Trabajar independientemente cada uno de los segmentos digestivos
§  Eliminar los contenidos digestivos cuando existen
§  Lavar chorro logrando que la mucosa quede en el lavado
§  Del contenido total del lavado de cada porción, se agita y se toma el 20% como
§  representativo de la muestra
§  El contenido tomado se preserva con igual cantidad de formol al 10%
§  Se revisa todo el contenido mirando al esteromicroscopio, pequeñas cantidades del material  depositadas en una caja de petri
§  Aislar el material obtenido de la pesca
§  Conservar el material aislado en frascos con formol al 10%
§  Montar entre lamina y laminilla los parásitos agregándoles 1-2 gotas de lactofenol para aclarar y observar mejor las estructuras del parásito
                                                                                                
METODOS DE COLORACIÓN Y MONTAJE DE HELMINTOS
 Los helmintos de importancia en Medicina Veterinaria, corresponden a los tremátodos, cestodos y nematodos, con características morfológicas y tamaños diferentes, lo que implica la utilización de diferentes técnicas para su aclaración, coloración y montaje y permitir a los parásitólogos la identificación de partes para llegar a la clasificación de géneros y especies 

Montaje y coloración de tremátodo y cestodos   La estructura de los helmintos tremátodos y cestodos se caracteriza por ser aplanados dorsoventralmente con espesores diferentes.  Para el caso de los tremátodos, unos pueden ser delgados y aplanados  ( duelas ) y otros robustos. con forma de pera.  Los tremátodos robustos se trabajan por cortes histológicos
Técnica
§  Fijar o conservar los tremátodos en formol acético alcohólico
§  Comprimir al tremátodo entre dos láminas 
§  Sumergir en el líquido fijador durante 24 horas
§  Pasarlos por alcohol al 70% durante 6 horas
§  Pasarlos a paracarmín durante 24 horas
§  Pasarlos en alcohol ácido durante 15 minutos
§  Alcohol al 70% durante 30 minutos
§  Alcohol absoluto  durante 60 minutos
§  Montar en bálsamo o glicerina gelatinada
§  Secar las láminas a la estufa y rotular

Montaje y coloración de nematodos  Los nematodos pueden presentarse de tamaños diferentes, unos son microscópicos mientras que otros, alcanzan longitudes próximas al metro. Por lo general, el montaje se hace para parásitos pequeños

Técnica
§  Lavar con solución salina fisiológica los parásitos recolectados
§  Fijarlos en alcohol al 70% o formol al 5%
§  Conservarlos en formol al 5%
§  Pasarlos a paracarmín durante 24 horas
§  Pasarlos por alcohol al 70% durante 30 minutos
§  Pasarlos en alcohol ácido durante 15 minutos
§  Alcohol al 70% durante 30 minutos
§  Alcohol absoluto  durante 60 minutos
§  Montar en bálsamo o glicerina gelatinada
§  Secar las láminas a la estufa y rotular

DIAGNOSTICO DE  LARVAS DE HELMINTOS EN SANGRE
Algunos helmintos como las filarias aunque presenten en su estado adulto localizaciones diferentes como corazón, testículos o cavidad peritoneal, tienen la propiedad de evolucionar en forma especial, caracterizándose por ser vivíparos u ovovivíparos, produciendo grandes cantidades de larvas (microfilarias) que toman la circulación en la búsqueda de sus huéspedes intermediarios (artrópodos hematófagos como mosquitos, pulgas y garrapatas) para continuar su evolución.  Razón por la cual, la muestra a enviar para el diagnóstico es necesariamente sangre con anticoagulante para el reconocimiento del estado larval.  Se recomienda la toma  de las muestra en las horas de la tarde ( 5 a 7 p.m.) por ser mas abundante el número de larvas

Técnica  sencilla
§  Tomar una gota de sangre fresca
§  Colocarla en una lámina y cubrirla con una laminilla
§  Mirar al microscopio con objetivo de 10X y reconocer las microfilarias
§  Reportar los resultados como positivo o negativo a microfilarias

Técnica del microhematocrito
§  Llenar varios tubos de microhematocrito con sangre sin coagular
§  Taponar uno de los extremos con plastilina
§  Centrifugar los microhematocritos a 1500 r.p.m. durante 3 minutos
§  Colocar los microhematocritos en una lámina y fijarlos con plastililna
§  Observar en la división del sedimento y el plasma
§  Reportar los resultados como positivo o negativo a microfilarias

Técnica de knott modificado
§  Colocar en un tubo de ensayo 1 cc de sangre sin coagular.
§  Agregar 10 cc de formol al 25% en solución amortiguadora
§  Tapar el tubo y homogenizar suavemente
§  Centrifugar a 1500 r.p.m. durante un minuto
§  Decantar el líquido sobrenadante
§  Agregar 1-3 gotas de azul de metileno
§  Tomar con un gotero el sedimento y preparar extendidos de varias láminas
§  Observar al microscopio con objetivo de 10X y 40X
§  Reportar los resultados como positivo o negativo a microfilarias